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          大鼠納豆激酶(NK)ELISA試劑盒操作說明

           更新時(shí)間:2023-07-18 點(diǎn)擊量:262

          大鼠納豆激酶(NK)ELISA試劑盒操作說明

          大鼠納豆激酶(NK)ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)原理

          大鼠納豆激酶(NK)ELISA試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)。往預(yù)先包被大鼠納豆激酶(NK)捕獲抗體的包被微孔中,依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并徹di洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的大鼠納豆激酶(NK)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計(jì)算樣品濃度。

          樣本處理及要求

          1.  血清:將收集于血清分離管的全血標(biāo)本在室溫放置2小時(shí)或4℃過夜,然后1000×g離心20 分鐘,取上清即可,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
          2.  血漿:EDTA或肝素作為抗凝劑采集標(biāo)本,并將標(biāo)本在采集后的30分鐘內(nèi)于2-8℃ 1000×g離心15分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
          3. 組織勻漿:用預(yù)冷的PBS (0.01M, pH=7.4)沖洗組織,去除殘留血液(勻漿中裂解的紅細(xì)胞會(huì)影響測量結(jié)果),稱重后將組織剪碎。將剪碎的組織與對(duì)應(yīng)體積的PBS(一般按1:9的重量體積比,比如1g的組織樣品對(duì)應(yīng)9mL的PBS,具體體積可根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整,并做好記錄。推薦在PBS中加入蛋白酶抑制劑)加入玻璃勻漿器中,于冰上充分研磨。為了進(jìn)一步裂解組織細(xì)胞,可以對(duì)勻漿液進(jìn)行超聲破碎,或反復(fù)凍融。最后將勻漿液于5000×g離心5~10分鐘,取上清檢測。

          4. 細(xì)胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本:1000×g離心20分鐘,取上清即可檢測,或?qū)⑸锨逯糜?20℃或-80℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融。

          注:標(biāo)本溶血會(huì)影響最后檢測結(jié)果,因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測。

          需要而未提供的試劑盒器材

          1.酶標(biāo)儀(450nm

          2.高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL2-20uL20-200uL200-1000uL

          3.37℃恒溫箱

          4.蒸餾水或去離子水

           

          名稱

          96孔配置

          48孔配置

          備注

          微孔酶標(biāo)板

          8×12

          8×6

          標(biāo)準(zhǔn)品

          0.3mL*6

          0.3mL*6

          樣本稀釋液

          6mL

          3mL

          檢測抗體-HRP

          10mL

          5mL

          20×洗滌緩沖液

          25mL

          15mL

          按說明書進(jìn)行稀釋

          底物A

          6mL

          3mL

          底物B

          6mL

          3mL

          終止液

          6mL

          3mL

          封板膜

          2

          2

          說明書

          1

          1

          自封袋

          1個(gè)

          1個(gè)

          1、標(biāo)準(zhǔn)品濃度依次為詳見說明書;

          2、經(jīng)過大量正常標(biāo)本檢驗(yàn),標(biāo)本的正常濃度值均在試劑盒提供的檢測范圍內(nèi),實(shí)驗(yàn)過程中直接取50μL樣本上樣即可。當(dāng)有部分樣本值超過最大標(biāo)準(zhǔn)品濃度時(shí),可用樣本稀釋液將標(biāo)本進(jìn)行適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

           

          注意事項(xiàng)

          1、嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃。使用后立即冷藏保存試劑。

          2、洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。

          3、消除板底殘留的液體和手指印,否則影響OD值。

          4、底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色,已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用。

          5、避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果。

          6、在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。

          7、平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上。

          8、任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。

          9、不能使用過期產(chǎn)品。

          10、如果可能傳播疾病,所有的樣品都應(yīng)管理好,按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測裝置。

          試劑準(zhǔn)備

          試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

          2洗滌緩沖液的稀釋:蒸餾水按120稀釋,即120×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

          操作步驟

          1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃

          2. 設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔,標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL

          3.樣本孔待測樣本50μL;空白孔不加。

          4. 除空白孔外,標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min

          5. 棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液350μL,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機(jī)洗板)。

          6.每孔加入底物AB50μL37℃避光孵育15min

          7.每孔加入終止液50μL15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

          實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算

          所測標(biāo)準(zhǔn)品的OD值為橫坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)品的濃度值為縱坐標(biāo),在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得到直線回歸方程將樣品的OD值代入方程,計(jì)算出樣品濃度

          試劑盒性能

          1、檢測范圍:詳見產(chǎn)品說明書

          2、靈敏度:最di檢測濃度小于0.1 U/L

          3、特異性:不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。