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          大鼠磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)ELISA試劑盒技術(shù)指導(dǎo)

           更新時間:2022-09-20 點擊量:657

          大鼠磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)ELISA試劑盒技術(shù)指導(dǎo)

          本試劑僅供研究使用  

          目的:本試劑盒用于測定大鼠血清、血漿、組織勻漿及相關(guān)液體樣本中血漿磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)含量

          實驗原理

          試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預(yù)先包被血漿磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)抗體的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在血漿磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的血漿磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度.

          試劑盒組成

          試劑盒組成

          48孔配置

          96孔配置

          保存

          說明書

          1份

          1份


          封板膜

          2片

          2片


          密封袋

          1個

          1個


          酶標包被板

          1×48

          1×96

          2-8℃保存

          標準品

          0.3ml×6管

          0.3ml×6管

          2-8℃保存

          酶標試劑

          5 ml×1瓶

          10 ml×1瓶

          2-8℃保存

          樣品稀釋液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          顯色劑A液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          顯色劑B液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          終止液

          3 ml×1瓶

          6 ml×1瓶

          2-8℃保存

          20×濃縮洗滌液

          15ml×1瓶

          25ml×1瓶

          2-8℃保存

          樣本處理及要求

          1. 血清:室溫血液自然凝固10-20分鐘,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如出現(xiàn)沉淀,應(yīng)再次離心。

          2. 血漿:應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,混合10-20分鐘后,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)該再次離心。

          3. 尿液:用無菌管收集,離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清,保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

          4. 細胞培養(yǎng)上清:檢測分泌性的成份時,用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時,用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液,細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復(fù)凍融,以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成,應(yīng)再次離心。

          5. 組織標本:切割標本后,稱取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐3?-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉(zhuǎn)/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測,其余冷凍備用。

          6. 標本采集后盡早進行提取,提取按相關(guān)文獻進行,提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗,可將標本放于-20℃保存,但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

          7. 不能檢測含NaN3的樣品,因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。


          操作步驟

          1.從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃

          2.設(shè)置標準品孔和樣本孔,標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;

          3.樣本孔先加待測樣本10μL,再加樣本稀釋液40μL;空白孔不加。

          4.除空白孔外,標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體100μL,用封板膜封住反應(yīng)孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

          5.棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復(fù)洗板5次(也可用洗板機洗板)。

          6. 每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。

          7.每孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

          注意事項:

          1.試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡15-30分鐘后方可使用,酶標包被板開封后如未用完,板條應(yīng)裝入密封袋中保存。

          2.濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出,稀釋時可在水浴中加溫助溶,洗滌時不影響結(jié)果。

          3.各步加樣均應(yīng)使用加樣器,并經(jīng)常校對其準確性,以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi),如標本數(shù)量多,推薦使用排槍加樣。

          4.請每次測定的同時做標準曲線,建議做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高(樣本OD值大于標準品孔di一孔的OD值),請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)(n倍)后再測定,計算時請最后乘以總稀釋倍數(shù)(×n×5)。

          5.封板膜只限一次性使用,以避免交叉污染。

          6.底物請避光保存。

          7.嚴格按照說明書的操作進行,試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.

          8.所有樣品,洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。

          9.本試劑不同批號組分不得混用。

          10.如與英文說明書有異,以英文說明書為準。

          計算

          以標準物的濃度為橫坐標,OD值為縱坐標,    

          在坐標紙上繪出標準曲線,根據(jù)樣品的OD      

          值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度;再乘以稀釋      

          倍數(shù);或用標準物的濃度與OD值計算出標      

          準曲線的直線回歸方程式,將樣品的OD值      

          代入方程式,計算出樣品濃度,再乘以稀釋      

          倍數(shù),即為樣品的實際濃度。                  

          試劑盒性能:

          1.樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.95以上。

          2.批內(nèi)變異系數(shù)與批間變異系數(shù)應(yīng)分別小于10%和15% 。

          保存條件及有效期:

          1.試劑盒保存: 2-8

          2.有效期: 6個月